NC | 停滞核糖体与外显子连接复合物的研究

导读

外显子连接复合物（EJC）是存在于真核生物中的多蛋白复合物。它们由三个核心蛋白eIF4A3/DDX48、MAGOH和Y14/RBM8A组成，并与多个辅助伙伴相互作用。

EJC主要通过激活带有早终止密码子（PTC）且位于最后一个内含子之前转录物的无义介导降解（NMD）来参与mRNA质控。此外，EJC还影响可变剪接、转录物核输出、翻译效率和抑制mRNA的m6A甲基化。

EJC在外显子-外显子连接处由剪接体组装，这是一个在snRNA和蛋白质组成上经历广泛变化的RNA/蛋白质结构。根据模型，EJC在mRNA输出到细胞质的过程中伴随mRNA，随后第一个翻译的核糖体将其推出，如果EJC没有被移除，它们会招募NMD因子并激活转录产物降解。

EJC也可以通过某些非翻译依赖机制被移除，并且NMD可以独立于EJC发生。然而，EJC的组装和解离的动态过程如何影响翻译调控，具体细节尚不清楚。

2024年5月17日，法国IBENS研究所Hervé Le Hir团队在Nature Communications上发表了一篇题为“Exon-junction complex association with stalled ribosomes and slow translation-independent disassembly”的论文，文章使用NanoBiT分裂荧光素酶系统监测EJC核心亚基Magoh和eIF4A3的相互作用，测量及评估翻译依赖和非翻译依赖的EJC解离机制，并揭示了EJC与核糖体的稳定关联。

文章索引

【标题】Exon-junction complex association with stalled ribosomes and slow translation-independent disassembly

【发表期刊】Nature Communications

【发表日期】2024年5月17日

【作者及团队】法国IBENS研究所Hervé Le Hir团队

【IF】16.6

研究结果

一. 工程化EJC-NanoBiT

作者使用NanoBiT蛋白互补检测系统研究EJC解离。NanoBiT将纳米荧光素酶分为LgBiT和SmBiT两个片段，分别融合到目标蛋白的N端或C端。

EJC核心由eIF4A3、MAGOH和Y14组成。团队将SmBiT和LgBiT分别融合到MAGOH的C端和Y14的N端，共同转染的细胞显示出高荧光素酶活性。

为了检测EJC组装，他们将SmBiT和LgBiT分别融合到eIF4A3和MAGOH的C端，结果也显示出高荧光素酶活性，表明EJC成功组装。

二. 影响EJC形成的突变也会削弱EJC-NanoBiT活性

作将野生型和缺陷型MAGOH或eIF4A3突变体分别与对方共表达，突变体的荧光素酶活性显著降低，这表明荧光素酶活性反映了EJC NanoBiT复合物的形成。

最终，他们在HEK293细胞中建立了共表达野生型MAGOH-C-LgBiT和eIF4A3-C-SmBiT的稳定细胞系。

三. EJC颗粒非常大，含有核糖体

为了研究EJC-NanoBiT颗粒，作者从表达细胞中提取低离子强度提取物，通过蔗糖梯度超速离心分级。荧光素酶活性分布在大多数级分中，峰值在双体大小，未经标记的EJC也显示相似的分布，大部分EJC核心蛋白未组装。

EJC颗粒的平均大小非常大，表明其含有多个核糖体。通过免疫沉淀发现18S和28S核糖体RNA，这确认了EJC相关的mRNP中包含核糖体。

用翻译抑制剂处理细胞后，EJC颗粒的平均大小显著增大，这表明翻译抑制剂会增加EJC相关mRNP中的核糖体数量。总体而言，停滞的核糖体导致了EJC颗粒的巨大尺寸。

三. 增加离子强度能缓解EJC-核糖体颗粒的限制

在高盐和RNase条件下，大型NanoBiT EJC颗粒消失，而荧光素酶活性显著增加，表明增加离子强度促进了EJC的RNase消化和EJC-NanoBiT荧光素酶活性。

在分级实验中，EJC核心亚基在梯度顶部和中部分级中发现，但共免疫沉淀只在中部分级中观察到。增加离子强度和RNase处理显著改变了共免疫沉淀的分布，但EJC核心仍然保持组装状态。

四. EJC解体经由快速翻译依赖途径和缓慢翻译非依赖途径发生

作者研究了EJC解体的动态过程，直接在细胞裂解液中测量NanoBiT的活性。荧光素酶活性在细胞培养几小时后保持稳定，表示EJC组装和解体达到了平衡。当转录被抑制时，EJC的活性随着时间的推移而降低，这表明EJC被解体。

进一步分析显示，依赖于翻译的EJC解体速度比翻译无关的速度快15倍以上，而且仅涉及稳态下31%的EJC。

五. 易于依赖翻译解体的EJC组装也是一个快速的过程

研究团队想了解新沉积的EJC是否更可能通过翻译依赖（TD）或翻译非依赖（TinD）的方式进行解体。在稳态下，尽管组装速度更快，但“不稳定”的EJC积累较少，因为它们的解离速度比“稳定”的EJC快得多。

令人矛盾的是在稳态下，大多数新沉积的EJC很可能通过快速的翻译依赖过程进行解体。EJC从mRNA中的去除已被认为同时遵循依赖于翻译和独立于翻译的机制。

六. 在恢复转录后观察EJC的组装

添加翻译抑制剂后，裂解液中的荧光素酶活性增加，30分钟内达到了平台期。

转录恢复后，荧光素酶活性迅速增加。分析显示，存在环丙沙星时的恢复速度比没有环丙沙星时快3.4倍，这表明转录是EJC组装的必要条件，但这一过程并不需要新的蛋白质合成。

七. RIP-测序是EJC结合转录本的研究方法

研究团队通过对人真核翻译起始因子eIF4A3基因进行N-末端HA标记，建立了细胞系。经过筛选，获得了4326个符合条件的基因，这些基因中的3/4在免疫沉淀物中富集。

利用线粒体基因编码的转录本，评估EJC结合转录本的“真实”数量。分析两个生物学重复的数据后发现，EJC结合转录本的读数存在一定的相关性。

八. 与EJC的转录特异性结合

作者系统地检查了546个基因，它们平均显示出4倍以上的富集，因此明确地与EJC结合。

他们对两个生物学重复中最丰富的50个基因进行了系统检查，对比了免疫沉淀（Ab0）和空白（blk0）的轨迹。一些典型的例子展示了相邻基因之间的不同特征，以及EJC结合转录本与输入转录本之间的差异。

九. EJC与特定转录本的持久性

作者测试了转录停滞后与EJC结合的转录本的持久性。他们观察了未经处理和经过不同时间DRB处理后的Ejc(g)变化，结果显示了转录本持久性的差异。这表明，EJC-RNA复合物的寿命与转录本相关，并且EJC富集在转录本中存在一定的偏倚。

总结

EJC是剪接过程中沉积在外显子-外显子连接处的复合物，主要用于激活携带过早终止密码子的转录本的降解。本文研究发现，这些复合物与核糖体稳定关联，85%的新沉积EJC通过依赖于翻译的机制解组，揭示了EJC与核糖体的稳定关联。

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