Mol Cell | 武汉大学周宇团队揭示核内滞留与顺序性多聚腺苷酸化决定核内转录后m6A修饰的机制

导读

m6A（N6-甲基腺苷）是mRNA中的主要修饰，涉及发育、免疫激活和细胞应对压力。m6A通过影响转录、RNA处理、核-质转运、降解和翻译来调节mRNA，通常发生在mRNA的3' UTR和长内含子上，与3' UTR长度正相关。

尽管有研究显示m6A可能抑制近端聚腺苷酸化位点（pPAS）的使用，但大多数m6A修饰实际发生在短3' UTR的mRNA上，提示它可能促进pPAS的使用。

m6A由METTL3-METTL14复合体催化，FTO和ALKBH5可逆转其修饰。转录因子CEBPZ和SMAD2/3，以及RNA聚合酶II（RNA Pol II）和H3K36me3组蛋白修饰，参与m6A的全局调节。

最近的研究显示，m6A主要在转录后增加，与新的逐步聚腺苷酸化模式有关，即远端PAS（dPAS）上的聚腺苷酸化mRNA可以在核出口前进一步在近端PAS（pPAS）得到处理，这些发现有助于解决m6A修饰在转录过程中还是转录后发生的问题。

024年8月9日，武汉大学生命科学学院周宇团队在Molecular Cell上发表了一篇题为“Nuclear retention coupled with sequential polyadenylation dictates post-transcriptional m6A modification in the nucleus”的论文，开发了4sU-coupled m6A水平和异构体特征化测序（4sU-m6A-LAICseq）及4sU-GLORI技术，以量化稳态和新合成RNA的m6A水平。揭示了许多转录本位点的m6A水平可能是转录后增强的，为当前关于共转录或转录后m6A修饰的争论提供了重要的见解。

文章索引

【标题】Nuclear retention coupled with sequential polyadenylation dictates post-transcriptional m6A modification in the nucleus

【发表期刊】Molecular Cell

【发表日期】2024年8月9日

【作者及团队】武汉大学生命科学学院周宇团队

【IF】15.58

研究结果

一. 4sU-m6A-LAIC-seq的开发

4sU-m6A-LAIC-seq是一种用于区分新合成RNA和稳态RNA中m6A水平的技术。

通过用4-硫尿苷标记新合成RNA，并使用IAA引发T-to-C转换，结合抗m6A抗体进行免疫沉淀，可以有效分离和量化m6A修饰的RNA。结果显示，这种方法能准确区分新合成RNA与稳态RNA，并有效量化其m6A水平。

二. 4sU-GLORI的开发

4sU-GLORI技术用于单核苷酸分辨率下量化新合成RNA和稳态RNA上的m6A水平。

该方法基于GLORI技术，通过4sU标记RNA、分离新合成和稳态RNA，并进行RNA测序和GLORI分析。结果显示，该技术能够准确测量m6A位点的绝对水平，验证了其在m6A水平量化中的有效性。

三. m6A阴性转录本的不完全剪接

m6A阴性转录本，尤其是10分钟标记的RNA，显示出更高的外显子-内含子或内含子-外显子接头比例，表明它们的剪接更不完全。

m6A阴性转录本的内含子保留比率较高，剪接不完整，尤其是在早期转录本中，这些结果暗示m6A可能主要在转录后而非转录过程中修饰RNA。

四. 广泛的转录后m6A修饰

作者通过计算SN m6A比率（稳态RNA与新合成RNA的m6A水平比值）发现，大多数RNA在转录后经历了m6A修饰。

数据显示，55.6%的蛋白编码基因在10分钟的4sU标记下具有较高的SN m6A比率，而仅有少数基因表现相反。m6A阴性转录本的T-to-C转换比率显著高于m6A阳性转录本，表明新合成RNA的m6A修饰较少。

此外，4sU-GLORI数据表明，m6A修饰在转录后广泛发生，尤其是在spolyA+ RNA中，m6A水平普遍高于npolyA RNA。

五. 转录后m6A修饰的特点

作者研究了转录后m6A修饰的特征，发现m6A增加的转录本在稳态RNA中的m6A水平较高，且具有较长的3' UTR和较少的外显子。

转录后m6A修饰主要发生在最后一个外显子，尤其是3' UTR部位，并且与位点的位置或确切序列无关。

分析显示，m6A高表达基因和m6A增加基因的富集相似，表明m6A水平高的转录本更容易经历转录后修饰。

六. 转录本中m6A水平较高的 RNA 在细胞核中的分布更加局限

转录后m6A修饰与RNA在细胞核中的停留时间相关。m6A水平较高的转录本在核基质中的富集程度更高，表明这些转录本在转录后可能停留较长时间。

长间隔非编码RNA（lincRNA）和上游反义RNA（uaRNA）的m6A水平通常高于mRNA，且与YTHDC1的依赖性增加，说明m6A修饰和YTHDC1对RNA的高效核出口至关重要。

七. RNA在细胞核中的滞留促进了m6A修饰

实验通过构建含有m6A位点的β-珠蛋白报告基因，发现无内含子的RNA其m6A水平显著高于有内含子的RNA。

此外，通过去除mRNA转运因子NXF1的实验也表明，RNA在核中的滞留时间越长，m6A修饰水平越高。这表明RNA核内滞留与m6A修饰的增强之间存在正相关关系。

八. m6A修饰对选择性聚腺苷酸化（APA）影响较小

作者发现一些基因的短3' UTR亚型比长亚型有更多的m6A修饰（如TRAF6），而其他基因则相反（如NANS）。

尽管m6A修饰与3' UTR的长度相关，但m6A对APA的影响有限。METTL3敲低后的APA模式变化较小，且APA因子与m6A修饰的关系不明显。

九. 顺序性多腺苷酸化生成m6A修饰的短3' UTR亚型

研究发现，m6A+短3' UTR亚型的pPAS使用频率低于长3' UTR亚型。dPAS与多腺苷酸化信号相关性更高，且dPAS通常先于pPAS使用。

在新合成RNA中，m6A修饰的短3' UTR亚型并未表现出明显的差异。顺序性多腺苷酸化过程中，dPAS使用较多，支持了m6A修饰的mRNA通过这种机制产生短3' UTR亚型。

十. 顺序性多腺苷酸化促进m6A修饰

为了进一步证实顺序性多腺苷酸化对m6A修饰的作用，作者发现m6A+短3' UTR转录本的较长3' UTR异构体主要富集在核基质中。m6A+短基因的SN m6A比率普遍高于m6A+长基因。

通过实验，研究团队发现插入到HBB报告基因中的长3' UTR异构体的m6A水平通常比短3' UTR高1.5到2倍。

总结

m6A修饰通常被认为是在转录过程中加入的，但本研究发现，许多m6A修饰实际上发生在转录后，尤其是在m6A水平较高的转录本上。短3' UTR异构体上的m6A水平更高，这可能与顺序性多腺苷酸化和较长核内停留时间有关。因此，m6A修饰在转录后发生，并与其他RNA代谢过程密切耦合，动态调节表观转录组学。

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