NAR | Ribo-seq应用：人类线粒体翻译因子TACO1减轻了多脯氨酸序列处的核糖体停滞

导读

人类线粒体基因组（mtDNA）编码13个氧化磷酸化（OXPHOS）酶复合物的蛋白亚基，这些复合物对有氧能量转导至关重要，mtDNA还编码所需的12S和16S rRNA以及22种tRNA。尽管近年来在线粒体核糖体结构和功能方面取得进展，但关于调节翻译延伸速率的因素仍不清楚。

目前有研究揭示，延伸速度受密码子选择、tRNA丰度和mRNA结构等多种因素影响。此外，脯氨酸残基可导致核糖体停滞，聚脯氨酸序列的合成需依赖辅助因子，如原核延伸因子P（EF-P）和真核起始因子5A（eIF5A），这两者通过特定的翻译后修饰来增强其功能。

线粒体翻译缺陷与多种线粒体疾病相关，目前已知的影响因子有富亮氨酸的五肽重复蛋白（LRPPRC）和细胞色素c氧化酶亚基1的翻译激活因子（TACO1）：

A）LRPPRC突变导致莱氏综合征，影响COX1和COX3 mRNA稳定性，造成呼吸复合物缺陷。

B）TACO1的突变则导致早期终止密码子和相关缺陷，尽管进行了一系列研究以阐明这些因子的功能，但其确切机制仍不明朗。

2024年9月9日，迈阿密大学Antoni Barrientos团队在Nucleic Acids Research上发表了一篇题为“The human mitochondrial translation factor TACO1 alleviates mitoribosome stalling at polyproline stretches”的论文，利用线粒体Ribo-seq和TACO1-KO细胞中翻译产物的代谢标记，证明了TACO1是作为线粒体全局翻译延伸的加速因子。

索引

【发表期刊】Nucleic Acids Research

【发表日期】2024年9月9日

【作者及团队】迈阿密大学Antoni Barrientos团队

【IF】16.97


研究结果

一. 缺乏TACO1会导致COX1和COX3的合成减少，以及新合成截短的多肽的积累

作者使用Cas9构建的TACO1缺失HEK293T细胞（TACO1-KO）显示，COX1和COX2水平显著降低，呼吸链复合体IV组装减少。COX1合成降至约10%，并检测到三种新型异常翻译产物。

虽然COX1等线粒体RNA水平相当，但TACO1-KO中COX1水平显著增加1.5倍，表明翻译异常转录物增强，重组TACO1的表达可恢复正常表型。

二. 新合成的截短多肽是早期释放的COX1片段

敲除TACO1的细胞显示COX1水平显著下降，且产生的截短多肽源于翻译中的提前终止。

进一步分析表明，TACO1-KO细胞中COX1和截短多肽的总水平与WT细胞相当，说明翻译缺陷发生在延伸阶段，而非翻译起始。puromycin实验表明，缺乏TACO1时，核糖体停滞的恢复效率较低。

三. TACO1与翻译中的线粒体核糖体会暂时相互作用

蔗糖梯度沉淀和FLAG亲和纯化显示少量TACO1与大亚基（mtLSU）共同沉淀，而未见小亚基（mtSSU）蛋白。OXA1L插入酶的共免疫沉淀表明TACO1在活跃翻译中与核糖体结合。

生物接近标记法（BioID）发现TACO1与多种线粒体翻译蛋白富集，表明TACO1在翻译过程中有限地结合于核糖体。

四. 所有线粒体多肽的合成，尤其是COX1和COX3，在聚脯氨酸序列处出现停滞现象

为研究TACO1在翻译中的作用，作者采用线粒体Ribo-seq核糖体印迹分析、WT、TACO1-KO和重建TACO1的细胞。结果显示，三种细胞系中线粒体核糖体在转录本上的占用率相似，表明TACO1-KO细胞中COX1和COX3合成降低并非由翻译起始故障引起。

通过识别到13个停滞事件，发现主要集中在COX1，且与聚脯氨酸序列相关。在缺乏TACO1时，核糖体在聚脯氨酸处停滞，严重影响COX1翻译。

此外，线粒体DNA编码的所有蛋白质中，几乎都有聚脯氨酸序列，而酵母中脯氨酸序列较少，导致TACO1缺失的表现微弱。聚脯氨酸可能有助于共翻译折叠和膜插入，特别是对于COX1蛋白质。

五. 线粒体核糖体在脯氨酸处的停滞是受上下游序列的影响的

核糖体在PP和PPP序列的停滞受新生多肽链上下游序列影响，尤其是邻近脯氨酸的氨基酸。mtDNA编码的15个含PP三联体中，仅5个引起停滞并且是TACO1的底物，只有中等或高停滞评分的序列会导致停滞。

ATP8中的PPQS*序列因与STOP密码子相近而未引起停滞，而COX1中的GCPPP则引发显著停滞。只有COX3的PSPWPL和ND2的LPYNPN引起停滞并可被TACO1缓解，部分非脯氨酸序列（如COX2中的DYGGL）也受TACO1影响。TACO1作为通用翻译延伸因子，作用于脯氨酸和非脯氨酸序列。

六. bL27m突变导致线粒体核糖体肽酰转移中心不稳定，揭示了TACO1对大多数线粒体多肽的影响

研究发现，DPC29/TACO1与线粒体核糖体蛋白bL27m的N端之间存在正向遗传相互作用。bL27m的N端富含丝氨酸（Ser）和赖氨酸（Lys），有助于稳定肽酰转移中心（PTC）。

在WT细胞中，bL27突变未影响线粒体蛋白合成。然而，在TACO1-KO细胞中，某些bL27突变加剧了COX1合成缺陷，并降低了整体翻译速率，这表明bL27m的N端和TACO1协同作用，稳定人类线粒体翻译中的PTC。

总结

本研究发现线粒体翻译因子TACO1对合成富含脯氨酸的细胞色素c氧化酶亚基COX1和COX3至关重要。TACO1通过与大核糖体亚基bL27m的N端协同作用，增强肽酰转移中心的稳定性，减轻多脯氨酸序列导致的核糖体停滞，揭示了TACO1在调节线粒体翻译效率中的重要性及其失调的病理学影响。

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