NBT | 刘如谦团队开发定向进化的工程化类病毒颗粒，提升生产和递送效率

导读

大分子递送到体外和体内细胞是许多治疗方法的关键。目前，基因编辑面临递送工具到目标细胞的挑战，AAV载体存在负载大小限制和脱靶编辑等问题，LNPs虽减少脱靶，但在肝外组织应用仍有难度。因此，急需开发新递送策略。

刘如谦团队之前研究了类病毒颗粒（VLPs）作为基因编辑载体，VLPs不含病毒基因组，结合了病毒递送的高效性和非病毒递送的暂时性优点。

他们开发的工程化VLPs（eVLPs）实现了高效蛋白递送和基因编辑，特别是在小鼠肝脏和视网膜中。通过优化eVLPs，提高了体内碱基编辑效率并减少了脱靶。此外，他们开发的prime editor（PE）-eVLPs实现了安全的体内递送。

为进一步提高eVLP性能，研究团队计划改进包装效率和递送效率，并通过定向进化优化eVLP变体。

2024年11月13日，博德研究所David R. Liu（刘如谦）团队在Nature Biotechnology上发表了一篇题为“Directed evolution of engineered virus-like particles with improved production and transduction efficiencies”的论文，开发了一个定向进化系统，通过带有barcode的sgRNA识别唯一的eVLP变体，筛选到了具有更好RNP包装、释放及递送效率的v5 eVLPs，为改进eVLPs提供了基础。

文章索引

【IF】46.9

研究结果

一. 带有barcode的sgRNA可识别具有不同特性的eVLPs

作者开发了一种定向进化系统，利用带有barcode的引导RNA（sgRNA）唯一标识每个eVLP变体。通过将带有barcode的sgRNA与eVLP变体共同表达，并经过选择后，通过测序识别优选变体。

在模拟选择实验中，证明了此方法能有效区分具有不同功能的eVLP变体，验证了该系统的有效性，为筛选具有期望特性的eVLP变体提供了新的方法。

二. 突变并筛选带有barcode的eVLP衣壳库

作者应用进化系统，突变并筛选了eVLP衣壳，以提高其包装ABE RNP货物的能力。

通过构建了一个包含3762个MMLV Gag蛋白突变体的barcoded eVLP衣壳库，并通过低MOI转导生产细胞，成功生成了带有barcode的eVLP生产细胞库。

高通量测序分析显示99%的barcode序列被检测到，为eVLP进化实验奠定了基础。

三. 筛选结果揭示了衣壳突变体如何影响eVLP特性

作者对barcoded VLP衣壳突变库进行了两次筛选，分别针对eVLP生产和转染效率进行优化。约8%的突变体在生产效率上优于经典eVLP衣壳，而0.7%的突变体提高了效率。

大多数突变体在生产和转染上表现不佳，少数突变体则在某一方面有所改善，表明eVLP生产和转染效率受不同机制调控。

四. 衣壳突变组合提高eVLP效能

通过对36种衣壳突变体的筛选和组合优化，作者发现GagC507V–ABE与GagQ226P–Pro–Pol组合（v5 BE-eVLPs）显著提高了eVLP的基因编辑效能，比v4 BE-eVLPs提高了3.7倍。

在小鼠细胞中，v5 BE-eVLPs也表现出更低的剂量需求，提升了效能。这些结果为提高eVLP的基因编辑效能提供了新的突变组合，并具有重要的应用潜力。

五. v5 eVLPs提升人类初级造血干细胞中的碱基编辑效能

v5 BE-eVLPs在初级人类造血干细胞中的碱基编辑效能比v4 BE-eVLPs提高2.6倍，且最低剂量即可达到v4的最高效能。

重要的是，v5 eVLPs不影响HSPC的存活性，显示出在大规模应用中的潜力。

六. v5 eVLPs表现出更好的负载和释放效果

v5 eVLPs通过Q226P和C507V突变改善了负载和释放。Q226P突变影响外壳成熟过程，优化大分子RNP包装，而C507V突变破坏了核衣壳结构中的锌指域，去除病毒基因组包装功能，促进RNP包装。

实验显示，v5 eVLPs在ABE蛋白和sgRNA包装量上分别提高1.8倍和4.3倍，且具有更高效的负载释放能力，显著提升了基因编辑效能。

七. v5 eVLPs表现出外壳结构和颗粒大小的变化

通过冷冻电镜分析，v4 eVLPs存在三种主要的衣壳结构：包膜未成熟、包膜成熟和无包膜成熟，而v5 eVLPs则主要呈现包膜未成熟、包膜不明确和无包膜未成熟结构。

v5 eVLPs缺乏成熟衣壳，可能通过未成熟衣壳提高了RNP载体的递送效率。此外，v5 eVLPs的平均直径较v4 eVLPs略大，可能能容纳更多货物。

总结

本文开发了一种eVLP进化系统，通过带有barcode的引导RNA标记变体，筛选出具有改进特性的eVLP。通过优化衣壳突变，开发了第五代（v5）eVLP，展示出比v4 eVLPs高2-4倍的递送效能。

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