NAR | Polysome profiling应用：m1Ψ修饰通过抑制Prkra介导的翻译抑制提升mRNA过表达的效率与特异性

体外转录（IVT）已成为基于mRNA的治疗、基因功能研究和遗传工具应用中的关键技术。然而，IVT过程会产生双链RNA（dsRNA）副产物，这些副产物被细胞内的dsRNA感受器识别，触发类似病毒感染的先天免疫应答，从而对细胞产生毒性。

在分化细胞中，这一应答主要由PKR、RIG-I等经典通路介导。在早期胚胎和多能干细胞中，存在一个由dsRNA结合蛋白Prkra介导的、绕开经典通路的独特应激反应机制，该机制会导致全局性的翻译抑制。

几十年来，在发育生物学研究中，研究人员广泛使用未修饰的IVT mRNA进行基因过表达，但其dsRNA副产物带来的潜在毒性及其对实验结果可靠性的影响一直被忽视。此外，作为mRNA疫苗关键技术的N1-甲基假尿苷（m1Ψ）修饰，是否以及如何影响Prkra介导的这一特殊应激反应，尚不明确。

2025年10月16日，山东大学邵明团队在Nucleic Acids Research上发表了一篇题为“N1-methylpseudouridine mRNA modification enhances efficiency and specificity of gene overexpression by preventing Prkra-mediated global translation repression”的论文。该研究系统性地揭示了IVT mRNA中的dsRNA副产物通过激活早期胚胎特有的Prkra通路，引发细胞坏死和发育停滞。

文章索引

【标题】N1-methylpseudouridine mRNA modification enhances efficiency and specificity of gene overexpression by preventing Prkra-mediated global translation repression

【发表期刊】Nucleic Acids Research

【发表日期】2025年10月16日

【作者及团队】山东大学邵明团队

【IF】13.1

研究结果

一、IVT mRNA中的dsRNA副产物对斑马鱼胚胎具有毒性

通过向斑马鱼早期胚胎注射常规方法合成的IVT mRNA，作者发现这会导致胚胎发育迟缓、畸形甚至死亡。

这种毒性效应与mRNA编码的蛋白质无关，而是与IVT过程中产生的dsRNA副产物的含量呈正相关。

通过纤维素层析法去除dsRNA后，mRNA的毒性显著降低。

二、dsRNA通过诱导细胞坏死和延迟MZT来发挥毒性

机制研究表明，dsRNA的毒性主要源于其诱导的广泛细胞坏死。

此外，dsRNA还会严重干扰早期胚胎的关键发育事件——母源-合子转换（MZT），表现为母源mRNA降解受阻、合子基因激活延迟以及关键的miR-430成熟受阻。

三、dsRNA的毒性效应依赖于Prkra介导的全局翻译抑制

作者发现，dsRNA诱导的毒性表型可以被翻译抑制剂（如环己亚胺）所模拟。

Polysome profiling多聚核糖体分析证实，在一个新构建的prkra基因敲除斑马鱼模型中，dsRNA无法再诱导全局翻译抑制，也无法引起细胞坏死和发育畸形。

这证明了dsRNA的毒性完全依赖于Prkra介导的翻译抑制通路。

四、dsRNA副产物导致实验假象并降低mRNA工具的效率

研究表明，dsRNA的全局翻译抑制效应会严重干扰基因功能研究，例如错误地导致基因过表达实验失败或产生误导性结果。

同时，它也显著降低了基于mRNA的基因编辑（CRISPR/Cas9）和转基因（Tol2转座）工具的效率。

五、m1ψ修饰能有效规避dsRNA的毒性效应并提高mRNA工具效率

作者发现，使用m1ψ替换尿苷（U）来合成mRNA，即使不经过纯化，其注射入胚胎后也几乎不产生毒性效应，并且不会抑制全局翻译。

相应地，使用m1ψ修饰的Cas9、Tol2转座酶或Cre重组酶mRNA，其在基因编辑和转基因等应用中的效率比未修饰的mRNA提高了数倍。

六、m1ψ修饰通过降低dsRNA与Prkra的结合亲和力来发挥作用

为了阐明m1ψ修饰的作用机制，作者进行了体外结合实验。

电泳迁移率变动分析（EMSA）显示，m1ψ修饰的dsRNA与Prkra蛋白二聚体的结合亲和力（Kd值）仅为未修饰dsRNA的约六分之一。

这直接导致了m1ψ修饰的dsRNA无法有效激活Prkra并募集翻译起始复合物，从而避免了翻译抑制，使得m1ψ修饰的mRNA能够被高效翻译。

总结

本研究系统地揭示了体外转录（IVT）mRNA在发育生物学应用中一个长期被忽视的陷阱：其dsRNA副产物会通过激活早期胚胎中特有的Prkra通路，引发全局翻译抑制，导致细胞坏死和发育异常，严重干扰实验结果的可靠性并降低基因工具的效率。这项工作不仅为在早期胚胎和干细胞中精准应用mRNA技术提供了关键的理论指导和优化策略，也深化了我们对不同细胞类型中dsRNA感知机制多样性的理解。