NBT | Ribo-seq应用：DNA化身向导，Cas12解锁RNA编辑新技能

CRISPR–Cas系统作为一种强大的基因编辑工具，已被广泛开发用于DNA和RNA的编辑及诊断应用。其中，II型Cas9和V型Cas12酶主要靶向并切割双链DNA，而VI型Cas13酶则以降解RNA而闻名。

这些Cas效应蛋白与其引导RNA（crRNA）之间的协同作用是实现精确核酸靶向的关键。crRNA通常包含一个保守的茎环结构，该结构对稳定结合Cas蛋白并激活其催化活性至关重要。

尽管研究人员已通过多种方式对crRNA进行工程改造以增强CRISPR系统的性能，但RNA的化学合成成本高昂、过程复杂，且其稳定性远不如DNA。这些因素限制了基于RNA引导的CRISPR技术在某些大规模或高通量应用中的普及。

2026年5月15日，佛罗里达大学Piyush K. Jain团队在Nature Biotechnology上发表了题为“DNA-guided CRISPR–Cas12 for cellular RNA targeting” 的研究论文。该研究发现反向设计的DNA引导（ΨDNA）能够替代传统RNA引导，使Cas12核酸酶在体外和细胞内进行精准的RNA靶向与多重转录本调控。

文章索引

【标题】DNA-guided CRISPR–Cas12 for cellular RNA targeting

【发表期刊】Nature Biotechnology

【发表日期】2026年5月15日

【作者及团队】佛罗里达大学Piyush K. Jain团队

【IF】41.7

研究结果

一、利用Cas12酶进行RNA检测的ΨDNA工程化改造

研究人员设计了一种具有3'端DNA手柄的反向引导（即ΨDNA），该结构能使AsCas12a和Cas12i1酶成功识别RNA并触发强烈的单链DNA反式切割。

通过高通量突变筛选证实茎环结构对稳定复合物至关重要，且经过优化的系统在临床样本中对丙型肝炎病毒RNA（如针对5' UTR和E2基因）实现了100%的准确检测。

二、ΨDNA与AsCas12a在HEK293T细胞中的翻译抑制

通过将编码AsCas12a、mCherry的质粒以及靶向mCherry起始密码子的ΨDNA共转染至HEK293T细胞中，研究人员成功诱发了核糖体停滞。

流式细胞术与实时荧光定量PCR结果表明，该系统利用无义介导的降解（NGD）途径，显著降低了目标蛋白的翻译和mRNA水平。

三、ΨDNA引导的AsCas12a可高效、低脱靶地敲低内源性RNA

该系统能够高效特异地敲低多种内源性mRNA，在稳定表达AsCas12a的细胞系中效率可达70-95%，且其脱靶效应远低于常用的RNA靶向工具RfxCas13d。

通过Ribo-seq核糖体印迹分析和CLIP-seq证实，该过程涉及诱导核糖体在靶点停滞，并确认了AsCas12a在ΨDNA引导下与细胞内靶标RNA的特异性结合。

四、AsCas12a与ΨDNA系统的潜在应用

共递送靶向DNA的crRNA和靶向RNA的ΨDNA，使得单一AsCas12a效应蛋白能够同时进行基因组编辑和RNA敲低，并支持针对多达四个内源基因的多重靶向。

此外，将AsCas12a与RNase H或甲基转移酶METTL3融合，实现了不依赖翻译途径的直接RNA降解以及位点特异性的m6A表观转录组学修饰。

总结

本文成功开发了一种名为ΨDNA的DNA引导型CRISPR-Cas12平台，有效克服了传统crRNA合成复杂且易降解的缺陷。该系统不仅在体外实现了高灵敏度的病毒RNA检测，还在活细胞内实现了低脱靶、高效率的多重RNA敲低、单蛋白双靶向以及表观转录组编辑，为基因调控和RNA靶向治疗提供了一个高度模块化且经济实用的工具箱。