综述 | Ribo-seq应用：寻找人类暗蛋白质组

人类基因组不仅包含经典的编码蛋白质基因，还包含大量非经典编码区，但后者的翻译产物长期以来处于未被充分探索的“暗区”。

尽管核糖体印迹分析和免疫肽组学等技术证实了这些区域能够翻译出微蛋白（共同构成“暗蛋白质组”），但如何将翻译噪音与具备生物学功能的非经典开放阅读框（ncORFs）区分开来，以及如何克服传统质谱对小蛋白的检测偏倚，仍是该领域的重大挑战。

2026年9月8日，德国海德堡大学Christoph Dieterich团队在Nature Chemical Biology上发表了一篇题为“Determining the dark proteome”的观点文章。该研究开发了一个基于蛋白质组学的系统注释框架，通过整合进化标记和功能基因组学数据，全面绘制了人类非经典蛋白质组的图谱，为将微小蛋白从零散发现推向系统性功能研究建立了全新的标准。

综述整理

一、“暗蛋白质组”的发现与技术瓶颈

1.1) 非经典翻译的兴起

几十年来，人类参考基因组的注释一直将蛋白质编码基因的数量锁定在约20,000个。然而，Ribo-seq核糖体印迹分析等技术的出现打破了这一传统认知。

研究表明，上游开放阅读框（uORFs）、长链非编码RNA（lncRNAs）以及假基因转录本中嵌入的短开放阅读框，均能翻译产生小蛋白或微蛋白。

这些非经典蛋白构成了“暗蛋白质组”，它们能够调节翻译、重塑细胞生理，甚至作为HLA分子呈递的抗原肽参与免疫反应。

1.2) 鉴定与验证面临的挑战

目前，区分无意义的翻译噪音与功能性微蛋白仍面临重重困难。

核心限制在于，传统质谱（MS）技术对小蛋白存在固有的检测偏倚，导致大量非经典蛋白被长期遗漏。

二、系统性注释框架与“Peptideins”概念

为了规范以往被忽视的分子的注释标准，Deutsch团队组建了TransCODE联盟，并开发了一套严密的蛋白质组学注释框架。

2.1) 多维数据的深度挖掘

研究团队挖掘了ProteomeXchange数据库中近10万项质谱实验数据。

通过结合常规蛋白质组学、专门富集的MHC呈递免疫肽组学以及Ribo-seq核糖体印迹分析数据，最大化了针对小蛋白和免疫肽的检测覆盖率，克服了单一质谱技术的偏倚。

2.2) 提出“Peptideins”概念与分级注释系统

该研究首次引入了“Peptideins”这一新概念，专门指代由ncORFs编码、已具备蛋白质水平证据但生物学功能尚未明确的小蛋白。

同时，团队创建了一个基于证据分级的注释系统：

• 1A级：有强效证据支持，值得被考虑为新的潜在蛋白质编码基因。

  
  

• 1B、2A和2B级：已有实验验证其RNA翻译和蛋白质合成，但尚无足够的功能证据将其完全升级为常规蛋白质基因。

  
  

2.3) ORBL进化评分系统

为了从进化角度补充注释证据，团队引入了“ORF相对分支长度”（ORBL）评分。

与以往依赖特定氨基酸序列的方法不同，ORBL评分利用多物种全基因组比对，专门量化有胎盘哺乳动物中“ORF特征”（如起始/终止密码子及连续阅读框）的进化保守性，并证明了这种进化约束与肽段可检测性之间存在显著关联。

三、深度功能基因组学评估

3.1) 敲除特征筛选与验证

在完成注释后，团队结合已发表数据与自身实验，对ncORFs进行了深入的功能基因组学评估。

经过严格的CRISPR敲除筛选，研究发现了51个具有“泛必需”（pan-essential）敲除特征的ncORFs。

3.2) OLMALINC功能的实验确认

作为核心候选者之一，研究团队对名为OLMALINC的进行了专门验证。

结果显示，其缺失会直接扰乱细胞的有丝分裂、染色体相关过程以及翻译和代谢网络，为暗蛋白质组的深层生物学功能提供了强有力的确证。

总结

Deutsch团队及其TransCODE联盟通过整合核糖体印迹分析、多模式质谱检测、进化评分（ORBL）与功能基因组学，成功将非经典ORF编码的微小蛋白从边缘化发现带入了系统性注释的正轨。“肽素”概念的提出以及分级注释框架的建立，为后续更深层次的生物医学研究奠定了标准。然而，该领域仍面临局限：传统质谱对小蛋白的敏感性依然不足，而免疫肽组学仅能反映进入抗原呈递途径的肽段。

未来，依赖合成肽技术和纳米孔肽测序等新兴靶向工具，以及统一和简化现有复杂术语（如采用“translon”等概念），将是全面解析人类暗蛋白质组功能网络的关键方向。